– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es la extracción de ADN genómico a partir de sangre (leucocitos)

– FUNDAMENTO

El ADN se encuentra en el interior del núcleo celular,para poder extraerlo es necesario romper las células y separar el núcleo para después volver a romperlo y liberar el ADN. Una vez liberado el ADN es necesario separarlo de las proteínas y provocar la precipitación de éstas para poder eluir el ADN. Este proceso conlleva tres fases: preparación de la muestra, extracción y purificación. En esta practica llevaremos a cabo la preparación de la muestra y la extracción de leucocitos. 

¿Qué son los leucocitos?

Los leucocitos, también conocidos como glóbulos blancos, son un componente importante de la sangre y una pieza clave en el sistema inmunológico del cuerpo.

– MATERIALES/ REACTIVOS

1. Micropipetas ajustables 
2. Vórtex
3. Centrífuga
4. MicroSpin columna       
5. Microtubo 1,5 ml
6. Puntas de micropipetas
7. Vasos de precipitado
8. Sangre
9. Tampón Lisis RCB
10. Tampón de lisis de Tejidos
11. Proteinasa K
12. Tampón de Lisis / Unión       
13. Etanol (96-100%)
14. Tampón de Desinhibición
15. Tampón de Lavado
16. Tampón de elución

– PROCEDIMIENTO

Antes de inicar nada, debemos concectar unos 15-20 minutos la cabina de bioseguridad para que los rayos UV tengan efecto y trabajemos con una técnica aséptica. Durante la espera un profesor cualificado procederá a extraer la sangre a utilizar a varios alumnos. 

Para ello, antes de introducir el material necesario rociaremos todo el material con alcohol 96º e inmediatamente lo introducimos en el interior de la cabina.

Una vez colocado todo el material en el interior de la cabina procedemos a pipetear 300 µl de sangre en un microtubo de 1.5 ml y añadimos 900 µl de Tampón Lisis RBC.

A continuación rotulamos para identificar la muestra:

Seguidamente,  lo ponemos en el Vortex e incubamos a temperatura ambiente durante 10 minutos en el baño termostático.

Centrifugamos a máxima velocidad durante 1 minuto y eliminamos el sobrenadante por decantación mejor que con micropipeta que puede aspirar el pequeño pellet celular no visible y dejar 10-20 µl de líquido residual.Volvemos a usar el Vortex para resuspender el pellet. 

Añadimos 180 µl de Tampón de lisis de Tejidos + 25 µl Proteinasa K y  resuspendemos el pellet de células con micropipeta e incubamos a 56º durante 15 minutos.

Repetimos el proceso añadiendo 200 µl de Tampón de Lisis / Unión, mezclamos con vortex e incubamos a 70ºC durante 10 minutos. Tras esto, añadimos 200 µl de Etanol (96-100%) al lisado  y mezclamos por vortex.

Pasamos la muestra a una MicroSpin columna con su tubo de recolección y centrifugamos a 8.000 rpm durante 60 segundos y eliminar el tubo de recolección. Si la muestra no ha pasado completamente, repetimos el paso de centrifugación.

A continuación, colocamos el  MicroSpin columna en un nuevo tubo de recolección y añadimos 500 µl de Tampón de Desinhibición. Centrifugamos a 12.000-14.000 rpm durante 60 segundos y eliminamos el líquido restante. 
 Así mismo, añadimos 500 µl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin columna, centrifugamos a 12.000 rpm durante 60 segundos y eliminamos el líquido.

Además debemos de realizar un 2º lavado en el que añadiremos 500 µl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin columna, volvemos a centrifugar a 14.000 rpm durante 60 segundos y eliminamos el líquido. Como hemos visto en cada fase debemos centrifugar y eliminar liquído para que quede aún más puro. 
Por último centrifugamos a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar el etanol residual, y finalmente eliminamos el tubo de recogida e  insertamos la spin columna en un microtubo de 1.5 ml

Debemos de añadir por último, 200 µl de Tampón de elución (precalentado a 70ºC) en el reservorio de la spin microcolumna e incubamos 1 minuto para posteriormente centrifugar a máxima velocidad durante 
 segundos. 
En este punto el microtubo contiene ahoraADN genómico.

Finalmente llevaremos al congelador los microtubos al congelador a -80º para 

conservarlo y poder realizar en los próximos días la PCR.

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

Usaer EPIs: bata, guantes.

Prestar especial atención a no utilizar nunca la cabina de flujo laminar con los rayos UV, tener cuidado cuando trabajemos con aparatos conectados a corriente eléctrica, concectar y desconectar con cuidado, con los derrames, etc, como el vórtex, baño termostático, centrífuga…
A la hora de centrifugar, verificaremos que los tubos están correctamente tapados y los equilibraremos (misma cantidad de volumen y colocándolos por pares en fundas opuestas). También comprobaremos que el rotor y la tapa de la centrífuga están bien colocados.

Utilizar siempre una técnica aséptica ya que se pueden contaminar con gran facilidad. 

– GESTIÓN DE RESIDUOS

Las jeringas utilizadas en la extracción de sangre se depositaran en un contenedor de objetos punzantes. 

Además, utilizamos un vaso de precipitado grande etiquetado como ‘residuos’ para depositar los precipitados y las puntas en él. 

– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es extraer  ADN de las células de las espinacas.

– FUNDAMENTO

– MATERIALES/REACTIVOS

1. Agua destilada en frasco lavador.
2. Espinacas.
3. Sal (NaCl)
4. Zumo de piña.
5. Detergente.
6. Alcohol.
7. Tubo de ensayo.
8. Balanza.
9. Vaso de precipitado.
10. Probeta.
11. Espátula.
12. Papel de filtro.
13. Embudo.
14. Varilla de vidrio.

– PROCEDIMIENTO

Comenzamos llenando medio vaso de precipitado de espinacas más o menos y tenemos que pesar la cantidad de espinacas que hemos puesto, para ello taramos el vaso de precipitado en la balanza y luego pesamos con las espinacas, dando un total de     gramos.

A continuación añadimos al  vaso de precipitado 200 ml de agua destilada. Para medirlos usaremos una probeta adecuada al volumen que necesitamos, vertiendo en ella el agua destilada. Una vez así, enrasaremos gota a gota con la pipeta Pasteur, hasta alcanzar los 200ml y lo añadimos al vaso de precipitado que contiene las espinacas. 

Por otro lado, pesamos una ‘pizca’ de sal (NaCl) en un vidrio de reloj de la misma manera que usamos la balanza anteriormente: colocamos el vidrio de reloj, lo taramos y echamos la pizca de sal que consideremos con nuestros dedos y anotamos el peso, para saber la cantidad y lo añadimos al vaso que contiene espinacas y agua destilada con una espátula sin que queden granos de sal adheridos al vidrio de reloj.

Para homogeneizar la mezcla; verteremos el contenido del vaso de precipitado en la batidora y la accionaremos, hasta obtener una disolución homogénea.

Además necesitamos un filtro para que la mezcla se filtre y quede adecuadamente, para ello usaremos papel de filtro, lo haríamos de la siguiente manera; 

Para filtrar la disolución de espinacas colocamos el filtro que hemos fabricado en el embudo y  la pondremos encima de un matraz que tenga una boca grande, quedándose el tubo del embudo dentro de dicho recipiente. Echaremos la mezcla sobre el filtro y dejaremos escurrir; cuando haya menos líquido cada vez será más difícil que filtre, así que deberemos utilizar la espátula o la varilla para ir moviendo lo que se encuentra sobre el filtro.

Medimos el volumen obtenido. Le tendremos que añadir 1/6 de detergente del volumen total a la disolución inicial; en nuestro caso, fueron  ml de detergente para 210 ml de disolución. Medimos los  ml con la probeta anterior y los verteremos en la mezcla; tras esto  mezclamos la disolución lentamente para que se produzcan las mínimas burbujas posibles.

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

Debemos mantener el espacio de trabajo limpio y ordenado para evitar derrames o caídas de materiales.

Tener cuidado a la hora de trabajar con la balanza y con la licuadora de no trabajar con las manos mojadas, evitar derrames, etc.

– GESTIÓN DE RESIDUOS

Los residuos generados como la pipeta Pasteur y los vasos de plástico deben ir al contenedor de residuos.

– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es la extracción de ADN de nuestra saliva de  forma «casera».

Es decir; preparanos para lo que vamos a trabajar este trimestre, la PCR. Para ello empezaremos desde el tejado de la casa.

– FUNDAMENTO

Como ya sabemos el ADN se encuentra en el interior del núcleo celular,para poder extraerlo es necesario romper las células y separar el núcleo para después volver a romperlo y liberar el ADN. Una vez liberado el ADN es necesario separarlo de las proteínas y provocar la precipitación de éstas para poder extraer el ADN. Extraeremos el ADN de una muestra de saliva, la cual en la boca arrastra las células del epitelio que recubre las paredes internas de la boca y que se están desprendiendo constantemente.

– MATERIALES/REACTIVOS

1. Tubos
2. Gradilla
3. Vasos de precipitado 1 y 2.
4. Cucharas
5. Agua destilada
6. Zumo de piña
7. Detergente: Fairy
8. NaCl
9. Vaso de plástico
10. Alcohol 96%
11. Pipeta Pasteur

– PROCEDIMIENTO

1. Nos enjuagamos la boca 30-40´, de esta forma obtenemos la muestra de saliva, y lo ponemos en un vaso de plástico.
2. Preparamos el VASO 1, añadiendo 5 cucharadas de agua destilada y 1/2 de sal.
3. Preparamos el VASO 2 , añadiendo 1 cucharada de detergente y 3 cucharadas de agua destilada.

4. Posteriormente añadimos 2 cucharadas de zumo de piña a la muestra.

5. Añadimos a la muestra 1 cucharada del VASO 1 y 1 cucharada del VASO 2  a la muestra.

6. Trasvasamos 15 ml a uno de los tubos.

7. Finalmente añadimos el doble de volumen del alcohol 96º muy lentamente a la muestra por la pared del tubo.

– ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

• Calcular medidas reales en g y ml–>  9,88 g de NaCl                                                             7,75 ml de agua destilada, zumo de piña y Fairy (equivale a 1 cucharada sopera)
• Explica para que sirven las siguientes mezclas:

1. Vaso 1: La sal en disolución actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que precipiten y se separen más facilmente del ADN.
2. Vaso 2: El detergente  utilizado en el experimento tiene como función destruir las membranas celulares del tejido vivo que estamos utilizando; el detergente disuelve las grasas, que es el componente principal de la membrana plasmática y nuclear de las células . Al romperse las membranas celulares se permite la salida del ADN al exterior.
3. Zumo de piña: Las enzimas son unas sustancias que atacan a las proteínas de las células, lo que permite romperlas y separarlas del ADN, que es el material que buscamos. Si no disponemos de enzimas, podemos utilizar zumo de piña (el cual contiene papaína, sustancia que degrada las proteínas).
4. Alcohol 96%: Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa

• ¿ Por qué no serviría este protocolo para dar un resultado fiable? Porque no todos seguimos las mismas medidas ya que trabajamos con cucharas soperas, cada una de su propia casa , cada cuchara portará una medida distinta.

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

Debemos usa EPIs como en todas las prácticas, bata, guantes,etc.

Tener cuidado de no derramar ninguno de los vasos, teniendo un espacio ordenado y despejado de cosas innecesarias.

– GESTIÓN DE RESIDUOS

Los residuos generados como la pipeta Pasteur y los vasos de plástico deben ir al contenedor de residuos.

– OBJETIVO

En esta práctica tenemos como objetivo realizar un frotis de sangre para su posterior observación al microscopio.

– FUNDAMENTO

En esta imagen podemos ver como debería de quedar:

– MATERIALES/REACTIVOS

1. Lanceta.
2. 2 portaobjetos.
3. Panóptico rápido Nº1, 2 y 3 (colorantes).
4. Frasco lavador con agua destilada.
5. Microscopio.
6. Papel de filtro

– PROCEDIMIENTO

Para extraer la muestra, pincharemos nuestro dedo presionando la parte superior de la lanceta   hasta que salga una gota de sangre. Con la otra mano haremos que la gota suba a través del tubo capilar ( un tubo de diámetro reducido en el que asciende la sangre por el método de adhesión y cohesión).

Sobre el portaobjetos quedará exceso de colorante que arrastraremos y desecharemos vertiéndole agua destilada.

Dejaremos secar y, finalmente, tendremos nuestra muestra lista para observar.

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

– GESTIÓN DE RESIDUOS

Como todos los residuos tendrán o serán restos biológicos, deberemos de desecharlos en el contenedor de residuos biológicos.

– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es la observación de los cromosomas al microscopio.

– FUNDAMENTO

– MATERIALES/REACTIVOS

1. Disolución de tripsina.
2. Tampón pH 6’8.
3. Colorante Giemsa.
4. Microscopio óptico.
5. Cubetas Coplin
6. Papel de filtro

– PROCEDIMIENTO

Comenzamos preparando los materiales sobre un papel de filtro. Primero preparamos la solución de bandeo mezclando el microtubo de tripsina previamente descongelada con el buffer.

Introducimos el porta en la tripsina unos 4-6 segundos.

Se amortiguará la acción de la tripsina introduciendo seguidamente el porta en solución tampón pH 6,8.

A continuación se prepara la solución de tinción, echando 10 ml de Giemsa en el bote con la solución tampón. Se introduce el porta en la solución preparada con Giemsa durante 2 minutos. 

Se lava el porta con agua del grifo, bajo el chorro y secamos o bien al aire o con mucho cuidado con papel de filtro y ya en este punto, podemos observar al microscopio.

– ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS AL MICROSCOPIO

Preparamos el microscopio con el objetivo de 10x para buscar metafases.

Encontramos esto:

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

– GESTIÓN DE RESIDUOS

En esta práctica no se generó ningún tipo de residuo

– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es obtener un  portaobjetos con muestras de linfoblastos rotos cuyos cromosomas se encuentren extendidos y en metafase.

– FUNDAMENTO

Realizaremos un  cariotipo de sangre periférica que previamente hemos cultivado en medio RPMI 1640 al que le hemos añadido fitohemaglutinina para desdiferenciar los linfocitos a linfoblastos y proliferarlos. En ésta parte del cariotipo detendremos la mitosis en metafase mediante colchicina, un fármaco antimitótico que detiene o inhibe la división celular al destruir el huso mitótico; ‘sacrificaremos’ la sangre (centrifugación y eliminación del sobrenadante, en el que se encontrará aquello que no necesitamos: glóbulos rojos, medio de cultivo, fijador de Carnoy sobrante…); fijaremos los linfoblastos con fijador de Carnoy y extenderemos los cromosomas vertiendo gotas de la disolución a una determinada altura.

– MATERIALES/REACTIVOS

1. Estufa de incubación.
2. Baño termostático.
3. Colchicina.
4. Cultivo de sangre con tripsina.
5. Micropipeta.
6. Puntas de micropipeta.
7. Centrífuga.
8. Vaso de precipitado.
9. KCl.
10. Tres pipetas Pasteur estériles: A (Pipeta de trabajo), B (Pipeta para rellenar) y C (Pipeta limpia).

– PROCEDIMIENTO

1. Incubación de la colchicina

Tras la incubación de la sangre a 37º, extraeremos el tubo de la estufa en cultivo para homogeneizar su contenido precipitado por el reposo con 0,25 ml de colchicina con la micropipeta.

Homogeinizamos presionando y aflojando el émbolo con suavidad porque los glóbulos rojos y leucocitos se encontrarán formando un coágulo en el fondo del tubo.

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

Tenemos que tener mucho cuidado al trabajar con sangre para no producir hemólisis, no formar burbujas, agitar tubos…

Colocar los tubos de forma equilibrada y simétrica en la centrífuga, y asegurarnos de cerrar bien su tapa.

Tener  cuidado con el material de vidrio, así como examinar el estado de las piezas antes de utilizarlas y desechar las que presenten el más mínimo defecto. También se desechará el material que haya sufrido un golpe de cierta consistencia, aunque no se observen grietas o fracturas.

Usar equipo de protección individual; utilizar bata (remangar las mangas), utilizar guantes y gafas en este caso no es necesario, para realizar una buena técnica aséptica.

– GESTIÓN DE RESIDUOS

Los sucesivos sobrenadantes los iremos vertiendo a un vaso de precipitado de pequeño volumen. Además el material desechable será colocado en un vaso de precipitado de mayor volumen.

Ambos vasos serán etiquetados como ´Residuos´.

– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es realizar  un cultivo celular de sangre periférica anticoagulada con heparina, el cual constará de diversos pasos que abarcarán varias prácticas.

– FUNDAMENTO

El cultivo celular es el proceso mediante el que células eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En este caso son células de sangre periférica, la cual ha sido extraida por un un profesional. Queremos que los linfocitos T de nuestra sangre se transformen en linfoblastos, para ello utilizaremos un medio especial; RPMI 1640 que induce la desdiferenciación de los linfocitos T.

– MATERIALES/ REACTIVOS

1. Sangre completa 0,4ml
2. Fitohemaglutinina 0,25ml
3. gradillas
4. puntas de pipeta
5. vaso de precipitado
6. Medio de cultivo RPMI 1640
7. micropipeta ajustable

– PROCEDIMIENTO

Para empezar, debemos desinfectar la superficie con alcohol al 70%, conectar la cabina de flujo laminar junto con la luz UV unos 15 minutos,  apagamos la luz UV una vez pasado el tiempo y conectamos la luz normal.

Por otro lado tenemos que sacar nuestro medio de cultivo guardado en la nevera y atemperarlo en el baño termostático a unos 37 grados centígrados antes de hacer la siembra.

Durante la espera , un profesor cualificado (enfermero) procede a sacarnossangre. La muestra sacada es de 1 ml y contiene heparina, un anticoagulante.

(Tapón verde)

A continuación, fijamos el volumen de 250 microlitros y abriremos los tapones de la fitohemaglutinina y del medio de cultivo, dejándolos  siempre boca arriba. Colocamos una punta  en la micropipeta y presionamos hasta el primer émbolo, lo dirigimos hasta el tubo de la fitohemaglutinina e introducimos la punta cogiendo la cantidad deseada y posteriormente añadirlo al tubo que contine el medio de cultivo.

Desechamos la punta de la micropipeta y la cambiamos para realizar el siguiente paso;

Volveremos a repetir el proceso, pero esta vez con la sangre completa , previamente deberemos mezclar la sangre para que todo contenga la misma cantidad de hematíes, glóbulos blancos, etc… .

Los 400 microlitros serán vertidos a la anterior disolución de fitohemaglutinina y medio RPMI 1640.

Una vez que tenemos listo todo, debemos dejar el tubo en estufa durante 72 horas.

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

Prestar atención a no utilizar  jamás la cabina de flujo laminar con la luz UV.

Usar equipo de protección individual; utilizar bata (remangar las mangas), utilizar guantes y gafas en este caso no es necesario, para realizar una buena técnica aséptica.

Tener especial cuidado al utilizar el baño termostático , ya que podemos sufrir de un choque eléctrico. Para ello no debemos llenar demasiado el baño termostático y evitar derrames.

– GESTIÓN DE RESIDUOS

La punta de micropipeta que ha entrado en contacto con la sangre y el tubo que contenía la muestra se desecharán en el contenedor de residuos biológicos. El resto son desechados en un vaso de precipitado etiquetado como ‘residuos’.

– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica será preparar fijador de Carnoy, el cual será utilizado posteriormente en el cariotipo de sangre periférica.

Cada uno de los grupos que estamos en clase nos hemos encargado de preparar los reactivos necesarios, tales como; solución de KCl, Buffer pH 6,8 , Tripsina y Giemsa.

,- FUNDAMENTO

Este reactivo lo utilizaremos posteriormente, se usa fijador de Carnoy (metanol-ácido acético en proporción 3:1), una sustancia que mantienen las estructuras celulares.

– MATERIALES/REACTIVOS

1-Ácido Acético Glaciar 30ml

2- Metanol 90ml

3- Gradilla

4- Frasco iso

5- Vaso precipitado

6- Embudo

7- Auxiliar de pipeteo

8- Pipetas de 50ml y 30ml

-PROCEDIMIENTO

Para empezar, debemos desinfectar la superficie con alcohol al 70%, conectar la cabina  y colocamos los materiales que necesitamos ordenadamente.

Antes de empezar el proceso etiquetamos el frasco iso (Fijador Carnoy), para evitar confusiones siempre debemos etiquetar todo. 

A continuación, colocamos el auxiliar de pipeteo en la pipeta  y cogemos 30 ml de ácido acético y lo dispensamos en el frasco iso , resaltar que no hicimos bien en pipetear cantidades tan grandes, debimos haberlo hecho con un vaso de precipitado pero queríamos ser lo más exactos posible.

En segundo lugar, repetimos el proceso pero con el metanol. Una vez que están los dos reactivos juntos en el frasco iso, lo mezclamos.

Este tipo de reactivo debemos almacenarlo a temperatura ambiente.

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

– GESTIÓN DE RESIDUOS

En este caso no hemos generado ningún tipo de residuo, ya que todo lo utilizado lo hemos lavado.

-OBJETIVO

El objetivo principal de la Citogenética es el diagnóstico de enfermedades genéticas. Para ello, la principal herramienta con la que se cuenta es el análisis del cariotipo.

– FUNDAMENTO

El cariotipo  es el conjunto de cromosomas de una especie, individuo o célula. Se representa con los cromosomas ordenados de acuerdo a su tamaño y morfología.

Los cromosomas humanos son estructuras altamente organicadas que están en el núcleo de las células y que contienen la información genética del individuo. Están compuestos por ADN e histonas, y adquieren esa forma durante el proceso de división celular o mitosis.

En la especie humana el número normal de cromosomas es 46, de los cuales 44 son autosomas y 2 son cromosomas sexuales; XX (mujeres) y XY (hombre). Los 44 autosomas corresponden a 22 parejas de cromosomas homólogos.

– MATERIAL/REACTIVOS

1.Pegamento

2. Tijeras

– PROCEDIMIENTO

Para elaborar un cariotipo, debemos recortar los cromosomas e ir pegándolos según nos indica la hoja, seguiremos esta plantilla para colocarlos;

Una vez que tenemos recortados los cromosomas, procedemos a pegarlos siguiendo el patrón anterior; en este caso tenemos 3 individuos que comparar, para comprobar si tienen alguna enfermedad o síndrome.

• INDIVIDUO 1: Se trata de un varón el cual no presenta ningún tipo de anomalía cromosómica y por lo tanto ningún síndrome. Está sano.

• INDIVIDUO 2:  Se trata de una mujer  la cual no presenta ningún tipo de anomalía cromosómica y por lo tanto ningún síndrome. Está sana.

• INDIVIDUO 3: Se trata de un varón el cual  presenta un tipo de anomalía cromosómica,  trisomía del 21 y por lo tanto Síndrome de Down o mongolismo.

– OBJETIVO

Identificar y contar el número de células viables de nuestro cultivo celular usando colorante azul tripán.

– FUNDAMENTO

La cámara de recuento de células, o hemocitómetro es un dispositivo utilizado para contar las células en un volumen específico de fluido. En este caso también se utilizará para diferenciar las células muertas de las vivas. Las células viables (vivas) se mostrarán de color blanco mientras que las células no viables se tiñen de color azul tripán.

¿ Por qué azul tripán?

Se usa el azul tripán, un colorante que penetra en las células que tienen la membrana rota, pero no en las células vivas. Por tanto al microscopio las células azules no son viables y las blancas si lo son.

– MATERIAL / REACTIVOS

1. Gradilla
2. Tubos Eppendorf
3. Vaso de precipitado
4. Cámara de Neubauer
5. Colorante azul tripán
6. Micropipetas de 10 y 20 microlitros
7. Puntas de micropipeta desechables
8. T-flask
9. Alcohol al 70%
10. Microscopio invertido

– PROCEDIMIENTO

Para empezar, debemos desinfectar la superficie con alcohol al 70%, conectar la cabina de flujo laminar junto con la luz UV unos 15 minutos,  apagamos la luz UV una vez pasado el tiempo y conectamos la luz normal.

A continuación, debemos desinfectar nuestras manos con los guantes puestos, todo el material que vamos a utilizar con alcohol al 70% antes de introducirlo en la cabina y antes de ponernos a trabajar, volveremos a rociarnos las manos con alcohol. Importante no sacar las manos de la cabina hasta terminar la práctica, a continuación colocamos todo el material que necesitamos ordenadamente con el fin de evitar algún derrame innecesario.

Importante , antes de trabajar con el T-flask, damos unos pequeños golpes en la parte inferior ( donde se encuentran las células adheridas) para que las células se suelten.

En primer lugar desenroscamos el tapón del T-flask  , pero sin llegar a quitarlos,  hasta que llegue el momento de trabajar con él. A continuación, colocamos la punta de micropipeta de 10 microlitros y procedemos a llenarla con nuestro medio de cultivo, para posteriormente vaciarlo en un tubo Eppendorf.  Una vez terminado este proceso, nos vamos a nuestra mesa para trabajar con el colorante y el microscopio invertido.

A continuación, añadimos 10 microlitros de colorante azul tripán al tubo Eppendorf ( contiene 10 microlitros de cultivo celular) y suavemente mezclamos pipeteando hacia arriba y hacia abajo, obteniendo en total 20 microlitros . Después, transferimos lentamente los 20 microlitros a un lado de la cámara de Neubauer , ésta se llenará por acción capilar.

Examinamos la cámara de Neubauer bajo el microscopio invertido usando el objetivo más bajo y enfocamos hasta poder ver las líneas de la rejilla en la cámara.

Finalmente, contamos las células dentro de cada una de las cuadrículas pequeñas y anotar el número de células vivas y muertas.

– ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Pudimos hacer el recuento pero solo de un cuadrante , y encontramos unas 12-14 células no viables y viables ninguna.

Como conclusión; la mayoría se encontraban en lisis celular, además en  nuestro microscopio no se podía ver bien ya que tenía la lente sucia o rayada.

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

Prestar atención a no utilizar  jamás la cabina de flujo laminar con la luz UV.

Usar equipo de protección individual; utilizar bata (remangar las mangas), utilizar guantes y gafas en este caso no es necesario, para realizar una buena técnica aséptica.

Tener especial cuidado al utilizar  el microscopio, ya que podemos sufrir de un choque eléctrico. Para ello debemos  evitar derrames.

Finalmente, prestar atención a los T-flask ya que no están del todo cerrados.

– GESTIÓN DE RESIDUOS

En este caso las puntas de micropipeta fueron depositadas en un vaso de precipitado, ya que, solo disponíamos de un solo contenedor para toda la clase. En éste, escribimos la palabra residuo, aunque deberían de ser depositadas en un contenedor de objetos punzantes.