– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es alimentar las células, introduciendo medio de cultivo.

– FUNDAMENTO

Las células de insectos que hemos cultivado necesitan una fuente de nutrientes para crecer y dividirse, los cuales los proporciona el medio de cultivo. Con el tiempo, las células agotan los nutrientes y factores de crecimiento  del medio.  Además, los medios de cultivo acumulan productos de desecho tóxicos de las células, por lo que es importante cambiar regularmente los medios.

– MATERIAL/ REACTIVOS

1. Medio de cultivo
2. Pipeta 2 ml.
3. Auxiliar de pipeteo ( automático)
4. T-flask
5. Baño termostático
6. Gradilla
7. Vaso precicipado

– PROCEDIMIENTO

Para empezar, debemos desinfectar la superficie con alcohol al 70%, conectar la cabina de flujo laminar junto con la luz UV unos 15 minutos,  apagamos la luz UV una vez pasado el tiempo y conectamos la luz normal.

Por otro lado tenemos que sacar nuestro medio de cultivo guardado en la nevera y atemperarlo en el baño termostático a unos 37 grados centígrados antes de añadir 2 ml a nuestro cultivo celular. 

A continuación, debemos desinfectar nuestras manos con los guantes puestos, todo el material que vamos a utilizar con alcohol al 70% antes de introducirlo en la cabina y antes de ponernos a trabajar, volveremos a rociarnos las manos con alcohol. Importante no sacar las manos de la cabina hasta terminar la práctica, a continuación colocamos todo el material que necesitamos ordenadamente con el fin de evitar algún derrame innecesario.

En primer lugar desenroscaremos los tapones , pero sin llegar a quitarlos, del tubo de Falcon ( contiene el medio de cultivo) y del T-flask , hasta que llegue el momento de trabajar con ellos.

 

Por un lado quitaremos el envoltorio de la pipeta a usar, retirando sólo la parte superior del envoltorio para evitar que la pipeta esté en contacto lo menos posible con el exterior, mientras que si permanece en el envoltorio seguirá estéril. Es importante trabajar dentro del rango de visión y asegurarse que la pipeta está en su línea de visión continuamente y no oculta por el brazo.

A continuación encajaremos el auxiliar de pipeteo  en la pipeta y ya retiraremos totalmente el envoltorio con mucho cuidado, tocándolo lo menos posible y depositando el envoltorio en el vaso de precipitado. De este modo procedemos a succionar el medio de cultivo (2 ml)  hasta llegar a la medida deseada, enrasamos y lo depositamos en el T-flask.

 

 

 

Una vez finalizado , procedemos a colocar todos los tapones en su correspondiente recipiente y cerramos muy bien, para que no se derrame nada, excepto el T-flask que debe permanecer un poco abierto.

Finalmente, volvemos a guardar el resto del medio de cultivo celular en la nevera para volver a utilizarlo en otro ocasión y guardamos el T-flask en la estufa de cultivos. Retiramos todas las pipetas usadas, frascos y materiales y volvemos a desinfectar la cabina conectando la cabina de flujo laminar junto con la luz UV unos 10-15 minutos.

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

Prestar atención a no utilizar  jamás la cabina de flujo laminar con la luz UV.

Usar equipo de protección individual; utilizar bata (remangar las mangas), utilizar guantes y gafas en este caso no es necesario, para realizar una buena técnica aséptica.

Tener especial cuidado al utilizar el baño termostático y el microscopio, ya que podemos sufrir de un choque eléctrico. Para ello no debemos llenar demasiado el baño termostático y evitar derrames.

Finalmente, prestar atención a los T-flask ya que no están del todo cerrados.

– GESTIÓN DE RESIDUOS

En este caso, usaremos un vaso de precipitado donde depositaremos las envolturas de las pipetas y las pipetas una vez que hemos terminado.

– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es observar el estado de nuestro cultivo celular, así como su salud siguiendo una serie de parámetros que ahora comentaré.

– FUNDAMENTO

Es importante examinar las células de insectos antes de cada experimento de cultivo celular para asegurar que estén sanas y libres de contaminación. Las células insalubres y apoptóticas mostrarán un aumento en las partículas pequeñas, la formación de vacuolas, la contracción celular, la aparición de «blebbing» en la membrana celular y la fragmentación del núcleo.

– MATERIAL/ REACTIVOS

1. T-flask (anteriores prácticas)
2. Microscopio invertido

– PROCEDIMIENTO

Para empezar tenemos que sacar el T-flask de la estufa de cultivo, el cual ha estado una noche incubándose, llevarla a la zona de trabajo del laboratorio  y debemos examinarlo en el microscopio invertido con una ampliación x40 para observarlas correctamente y ajuntaremos la fuente de luz deseada y enfocaremos los tornillos macrométrico y micrométrico hasta ver correctamente,  para comprobar el estado de nuestro cultivo y que no hay contaminación.

La observación microscópica puede revelar la fuente de contaminación en el cultivo celular, las cuales pueden ser bacterias, hongos y levaduras.

Primero debemos de sujetar el frasco contra la fuente de luz y comprobar que el medio está limpio. Las células deben ser visibles con una neblina pálida o un grupo de células en la superficie del interior del frasco y el medio en el que se encuentra debe ser claro y de color amarillo claro.

Para examinar las células bajo el microscopio invertido hay que buscar signos de células enfermas lo que podría indicar que tenemos que cambiar el medio de cultivo o necesitan ser subcultivadas. Si el cultivo está contaminado hay que añadir 1 ml de lejía  10% al frasco.

Debemos determinar si las células están listas para ser alimentadas o subcultivadas, o si requieren tiempo para crecer. Las células deben alimentarse cada 5 días y subcultivarse cada 10 días o cuando alcancen una confluencia de 80-  90%, lo que ocurra primero.

Esto fue lo que observamos el primer día;

A los  3 días volvimos a observar nuestro cultivo y apreciamos esto;

– ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

El primer día que observamos nuestras células, cabe destacar que están sanas y que no hay contaminación, no encontramos ni hongos, levaduras  ni bacterias, aunque observamos que algunas están en apoptosis. Nuestro cultivo celular tiene una confluencia del 25% aproximadamente.

En cuanto a las imágenes del tercer día destacamos que siguen sanas y sin ningún tipo de contaminación, el medio de cultivo se encuentra en buenas condiciones ya que tiene buen color por lo que en la siguiente práctica procederemos a la alimentación de nuestras células añadiendo medio de cultivo y podemos decir que la confluencia es de entre 25-50% aproximadamente.

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

Usar equipo de protección individual; utilizar bata (remangar las mangas), utilizar guantes y gafas en este caso no es necesario, para realizar una buena técnica aséptica.

Tener especial cuidado al utilizar el baño termostático y el microscopio, ya que podemos sufrir de un choque eléctrico. Para ello no debemos llenar demasiado el baño termostático y evitar derrames.

Finalmente, prestar atención a los T-flask ya que no están del todo cerrados.

– GESTIÓN DE RESIDUOS

En este caso, usaremos un vaso de precipitado donde depositaremos las envolturas de las pipetas y las pipetas una vez que hemos terminado.

– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es la siembra de células eucarióticas de insectos en el medio de cultivo (PRÁCTICA 3), en condiciones asépticas.

– FUNDAMENTO

El cultivo celular es el proceso mediante el que células eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término «cultivo celular» se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares.

– MATERIAL/ REACTIVOS

1. Medio de cultivo
2. T-flask
3. Pipeta de 10 ml
4. Pipeta de 2 ml
5. Auxiliar de pipeteo ( automático)
6. Alcohol al 70%
7. Baño termostático
8. Gradilla
9. Suspensión celular
10. Microscopio invertido

– PROCEDIMIENTO

Para empezar, debemos desinfectar la superficie con alcohol al 70%, conectar la cabina de flujo laminar junto con la luz UV unos 15 minutos,  apagamos la luz UV una vez pasado el tiempo y conectamos la luz normal.

Por otro lado tenemos que sacar nuestro medio de cultivo guardado en la nevera y atemperarlo en el baño termostático a unos 37 grados centígrados antes de hacer la siembra.

A continuación, debemos desinfectar nuestras manos con los guantes puestos, todo el material que vamos a utilizar con alcohol al 70% antes de introducirlo en la cabina y antes de ponernos a trabajar, volveremos a rociarnos las manos con alcohol. Importante no sacar las manos de la cabina hasta terminar la práctica, a continuación colocamos todo el material que necesitamos ordenadamente con el fin de evitar algún derrame innecesario.

Una vez colocado todo ordenadamente iniciamos la siembra. Empezamos desenroscando los tapones , pero sin llegar a quitarlos, del tubo de Falcon, del T-flask y del frasco del medio de cultivo para que luego nos sea más fácil trabajar, hasta que llegue el momento de trabajar con ellos.

 

Iniciamos el proceso, introduciendo con la pipeta de 10 ml, 10 ml de medio de cultivo al T-flask ( siguiendo el procedimiento de la práctica 3), además añadir 2 ml de la suspensión celular para hacer la siembra, hacerlo con especial cuidado y rápidamente porque se debe minimizar el tiempo que el medio y la placa están expuestos al ambiente para disminuir el riesgo de contaminación.

Cubrir el T-flask ( no lo cerramos herméticamente para que haya flujo de aire ) y lo colocamos  cuidadosamente en la cámara incubadora de cultivo celular preparada.

 

 

Finalmente, volvemos a guardar el resto del medio de cultivo celular en la nevera para volver a utilizarlo en los siguientes días para el cambio del medio celular. Retiramos todas las pipetas usadas, frascos y materiales y volvemos a desinfectar la cabina conectando la cabina de flujo laminar junto con la luz UV unos 10-15 minutos.

–  MEDIDAS DE SEGURIDAD

Prestar atención a no utilizar  jamás la cabina de flujo laminar con la luz UV.

Usar equipo de protección individual; utilizar bata (remangar las mangas), utilizar guantes y gafas en este caso no es necesario, para realizar una buena técnica aséptica.

Tener especial cuidado al utilizar el baño termostático y el microscopio, ya que podemos sufrir de un choque eléctrico. Para ello no debemos llenar demasiado el baño termostático y evitar derrames.

Finalmente, prestar atención a los T-flask ya que no están del todo cerrados.

– GESTIÓN DE RESIDUOS

En este caso, usaremos un vaso de precipitado donde depositaremos las envolturas de las pipetas y las pipetas una vez que hemos terminado.

– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es la correcta realización del trasvase de la penicilina del medio de cultivo celular, ya que es algo imprescindible para trabajar en el laboratorio.

Es importante preparar un área limpia designada antes de comenzar el cultivo celular.

Añadir que esta práctica la haremos primero con agua destilada y posteriormente, un compañero lo hará en condiciones reales con el medio de cultivo.

– FUNDAMENTO

La técnica aséptica se refiere al método preventivo que se emplea para mantener estériles  todos los objetos e instrumental. Se realiza con el fin de reducir al mínimo la posibilidad de contaminación por carryover (contaminación de sustancias amplificadas), por sustancias no amplificadas del propio trabajador y de la muestra. Por ello todo el procedimiento lo haremos dentro de la cabina de flujo laminar.

– MATERIAL/REACTIVOS

1. Alcohol del 70%
2. Medio de cultivo (contiene Penicilina)
3. Pipeta
4. Auxiliar de pipeteo automático
5. Gradilla
6. Vaso de precipitado
7. Tubo tipo Falcon
8. Agua destilada

– PROCEDIMIENTO

Antes de empezar, debemos desinfectar la superficie con alcohol al 70%, conectar la cabina de flujo laminar junto con la luz UV unos 15 minutos. A continuación apagamos la luz UV y conectamos la luz normal.

Para empezar debemos desinfectar nuestras manos con los guantes, todo el material que vamos a utilizar con alcohol al 70% antes de introducirlo en la cabina y antes de ponernos a trabajar, volveremos a rociarnos las manos con alcohol.

 

Importante no sacar las manos de la cabina hasta terminar la práctica, a continuación colocamos todo el material que necesitamos ordenadamente con el fin de evitar algún derrame innecesario.

En primer lugar desenroscaremos los tapones , pero sin llegar a quitarlos, del tubo de Falcon y del frasco del medio de cultivo para que luego nos sea más fácil trabajar, hasta que llegue el momento de trabajar con ellos.

 

Por un lado quitaremos el envoltorio de la pipeta a usar, retirando sólo la parte superior del envoltorio para evitar que la pipeta esté en contacto lo menos posible con el exterior, mientras que si permanece en el envoltorio seguirá estéril. Es importante trabajar dentro del rango de visión y asegurarse que la pipeta está en su línea de visión continuamente y no oculta por el brazo.

 

A continuación encajaremos el auxiliar de pipeteo, en este caso automático, en la pipeta y ya retiraremos totalmente el envoltorio con mucho cuidado, tocándolo lo menos posible y depositando el envoltorio en el vaso de precipitado. De este modo procedemos a succionar el medio de cultivo (12 ml), presionando sobre el botón superior del auxiliar hasta llegar a la medida deseada, enrasamos y lo depositamos en el tubo de Falcon, presionando el botón inferior del auxiliar.

Una vez finalizado el trasvase, procedemos a colocar todos los tapones en su correspondiente recipiente y cerramos muy bien, para que no se derrame nada.

 

Finalmente, volvemos a guardar el resto del medio de cultivo celular en la nevera para volver a utilizarlo.  Retiramos todas las pipetas usadas, frascos y materiales y volvemos a desinfectar la cabina conectando la cabina de flujo laminar junto con la luz UV unos 10-15 minutos.

–  MEDIDAS DE SEGURIDAD

Prestar atención a no utilizar  jamás la cabina de flujo laminar con la luz UV.

Usar equipo de protección individual; utilizar bata (remangar las mangas), utilizar guantes y gafas en este caso no es necesario, para realizar una buena técnica aséptica.

Es importante evitar trabajar en esta práctica en caso de alergia a la penicilina ya que el medio de cultivo la contiene.

– GESTIÓN DE RESIDUOS

En este caso la pipeta fue  depositada en un vaso de precipitado, junto con los envoltorios de los materiales. En éste, escribimos la palabra residuo.

– OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es utilizar la cabina de bioseguridad. Para ello vamos a empezar a familiarizarnos con éstas de tal forma que mediremos algunos volúmenes con las micropipetas.

– FUNDAMENTO

En nuestro laboratorio tenemos una cabina de flujo laminar, éstas son básicas, ya que lo más importante en el trabajo en Biología Molecular es evitar la contaminación de las muestras.

Esta cabina es de tipo II: es una cabina de flujo laminar, las mínimas para Biología Molecular. Protegen al trabajador, medio ambiente y la muestra. Hay varios tipos , pero en nuestro laboratorio tenemos de clase II B1; el aire ingresa a 50 cm/s, con filtros HEPA de extracción y superficie de trabajo. Reciclan el 30% del aire y renuevan el 70%.

 

– MATERIAL/ REACTIVOS

1. Micropipetas de distintos volúmenes
2. Vaso de precipitado
3. Tubos Eppendorf
4. Gradilla
5. Dos disoluciones con colorante; azul y amarillo.
6. Puntas de micropipeta
7. Papel de filtro

– PROCEDIMIENTO

Para empezar debemos desinfectar la superficie con alcohol de 70%, encender la cabina de flujo laminar y la luz UV unos 15-20 minutos antes de ponernos a hacer la práctica, que consiste en medir los siguientes volúmenes con las micropipetas.

 

Una vez pasado el tiempo, apagamos la luz UV y conectamos la luz normal, a continuación colocamos el papel de filtro sobre la superficie donde vamos a trabajar y todo el material que necesitamos ordenadamente con el fin de evitar algún derrame innecesario.

 

 

 

Por un lado,  seleccionar la micropipeta que vamos a utilizar según el volumen a dispensar, para evitar errores. Debemos usarla  siguiendo los pasos redactados en la prática 1, pero con una diferencia; tenemos dos disoluciones distintas y hay que mezclarlas en los tubos Eppendorf ; aspirar y soltar repetidas veces la disolución que contiene el tubo hasta que se mezcle bien.

Este proceso debemos hacerlo con cada una de las medidas que nos piden , hasta obtener los resultados correctos.

 

 

 

– MEDIDAS DE SEGURIDAD

Prestar atención a no utilizar  jamás la cabina de flujo laminar con la luz UV.

Usar equipo de protección individual; utilizar bata (remangar las mangas), utilizar guantes y gafas en este caso no es necesario.

Tener mucho cuidado con no colocar nunca la micropipeta boca abajo y prestar atención con las puntas de micropipeta.

– GESTIÓN DE RESIDUOS

En este caso las puntas de micropipeta fueron depositadas en un vaso de precipitado, ya que, solo disponíamos de un solo contenedor para toda la clase. En éste, escribimos la palabra residuo, aunque deberían de ser depositadas en un contenedor de objetos punzantes.

-OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es manejar correctamente las micropipetas, ya que es una actividad muy habitual en el laboratorio y debemos aprender correctamente como hacerlo.

-FUNDAMENTO

Vamos a utilizar la micropipeta ya que es un instrumento de uso habitual en nuestro laboratorio, debido a que trabajamos con cantidades muy pequeñas y no se pueden producir errores, como por ejemplo, en el cultivo celular.

Las micropipetas permiten medir volúmenes muy pequeños, del orden de microlitros. Con ellas se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de valores determinado por el modelo de micropipeta.

-MATERIAL/REACTIVOS

1. Micropipetas de distintos volúmenes
2. Vaso de precipitado
3. Tubos Eppendorf
4. Gradilla
5. Agua destilada
6. Puntas de micropipeta
7. Papel de filtro
8. Balanza

-PROCEDIMIENTO

Esta prácticas se divide en dos partes;

Medición de ciertos volúmenes: 1000µl, 550µl, 75µl, 20µl y 10µl.

Calibrar las micropipetas de 1000µl.

Primero debemos desinfectar la superficie de trabajo, colocar el papel de filtro sobre el que vamos a trabajar, a continuación colocamos todo el material que necesitamos ordenadamente con el fin de evitar algún derrame innecesario.

 

A continuación, seleccionar la micropipeta que vamos a utilizar según el volumen a dispensar, para evitar errores. En las micropipetas de rango variable hay que seleccionar el volumen a medir pero tener especial cuidado de no sobrepasar los volúmenes permitidos. Seleccionar la punta apropiada para la micropipeta, aplicando una presión suficiente para asegurar la hermeticidad. No usar nunca la pipeta sin la punta.  Colocar los tubos Eppendorf en las gradillas.

Para usar las micropipetas debemos primero apretar el botón pulsador hasta el primer tope, con la pipeta en posición vertical sumergir la punta 1-3 mm en la muestra y aspirar el líquido lentamente, relajando la posición del dedo sobre el botón pulsador. Debemos tener mucho cuidado porque puede entrar aire en la punta, lo que conduce a error. Esperar un segundo y retirar la punta del líquido.

Para depositar el líquido debemos colocar la punta contra la pared del tubo Eppendorf, apretar el botón pulsador hasta el primer tope, tras hacer esto debemos apretar hasta el segundo tope para vaciar el resto del líquido manteniendo apretado el botón en el segundo tope retirar la pipeta deslizando la punta por la pared del recipiente, soltar el botón y finalmente expulsar la punta con ayuda del botón de expulsión que tienen para ello.

Para calibrar las micropipetas hemos preparado 5 tubos Eppendorf con 1000µl.

Primero debemos tarar sobre la balanza un tubo Eppendorf vacío para que a la hora de pesar los otros tubos no cuente con el peso de los tubos, sino de lo que hay en su interior.

Una vez pesados los 5 tubos anotamos su peso para la posterior actividad:

1. Tubo 1-> 1,09
2. Tubo 2-> 1,10
3. Tubo 3-> 1,11
4. Tubo 4-> 1,12
5. Tubo 5-> 1.10

-ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Para comprobar la veracidad de los resultados debemos calcular:

• Precisión o error aleatorio; es decir, el % de desviación media.

 

 

• Exactitud o error sistemático; es decir, la desviación estándar.

-MEDIDAS DE SEGURIDAD

Usar equipo de protección individual; utilizar bata (remangar las mangas), utilizar guantes y gafas en este caso no es necesario.

Tener mucho cuidado con no colocar nunca la micropipeta boca abajo y prestar atención con las puntas de micropipeta.

-GESTIÓN DE RESIDUOS

En este caso las puntas de micropipeta fueron depositadas en un vaso de precipitado, ya que, solo disponíamos de un solo contenedor para toda la clase. En éste, escribimos la palabra residuo, aunque deberían de ser depositadas en un contenedor de objetos punzantes.